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羊膜及羊膜细胞外基质在组织工程中的应用

作者:佚名  发布时间:2017年12月21日  浏览次数:

1羊膜与羊膜细胞外基质作为组织工程支架材料的应用

1.1 构建周围神经组织工程修复材料

    随着神经生物学和组织工程技术的发展,为寻找神经替代物提供了崭新的思路。Mligiliche等将羊膜细胞外基质制成管状诱导周围神经再生,用以修复鼠坐骨神经缺损,发现修复结果与管径大小有关,合适管径的羊膜管能诱导坐骨神经再生。张琪等采用人羊膜衍生物膜、复合自体体外传代培养的许旺细胞进行桥接SD大鼠2.5 cm的坐骨神经缺损,神经成功再生,桥接物中可见丰富的新生血管和轴突再生并逐渐成熟,表明该神经替代物可引导神经的再生和延伸;羊膜衍生物膜支架材料结构的变化及其周围富含吞噬颗粒的巨噬细胞表明,羊膜衍生物膜被降解、吸收。桥接物及其远端神经中NF2200的阳性染色表明,受体神经中已有正常轴突。因此,复合自体体外培养的许旺细胞的羊膜衍生物膜是一种有效的神经桥接物替代材料,具有潜在的临床应用价值。

1.2 构建皮肤组织工程修复材料

    以骨髓间充质干细胞和表皮细胞作为组织工程种子细胞,选用人羊膜作为负载细胞的材料,将经处理的人羊膜分别负载经体外培养扩增的自体骨髓间充质干细胞和表皮细胞,并共同移植修复放创性皮肤损伤创面,取得了较好的促愈合效果。人羊膜负载骨髓间充质干细胞和表皮细胞植入15 d,创面组织内反应血管内皮细胞增殖的vWF蛋白表达增强,毛细血管、成纤维细胞数量增加,胶原合成增多,肉芽组织形成丰富;创口边缘处表皮移行加速,有利于创面上皮化覆盖,防止创面过度纤维化修复。
      以角朊细胞为组织工程种子细胞,选用人羊膜作为负载细胞的材料,光镜下人羊膜负载角朊细胞3 d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列。扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起。透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝。人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用。
    以人胚胎干细胞为组织工程种子细胞,选用人羊膜作为负载细胞的材料,在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,高度表达β1整合素、CK15、CK19。将羊膜定向诱导的表皮样干细胞在裸鼠腹腔微环境下具有分化为角化复层上皮、毛囊样、汗腺样和皮脂腺样结构的潜能。以羊膜定向诱导的表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,初步研究表明可重建皮肤缺损的表皮,并具有分化为一些皮肤附属结构的潜能。
    以成纤维细胞为组织工程种子细胞,选用羊膜细胞外基质作为负载细胞的材料,梭形的成纤维细胞在羊膜细胞外基质上生长良好,放射状或平行排列;组织切片发现羊膜细胞外基质上有较多梭形细胞附着,细胞排列紧密;电镜下见成纤维细胞胞膜基底部向羊膜细胞外基质内伸出数个突起,细胞与羊膜基质黏附相当牢固,胞外有较多胶原原纤维堆积。羊膜细胞外基质具有支架和渗透作用,成纤维细胞在其上生长、黏附良好,胶原合成、分泌旺盛,羊膜细胞外基质是一种较理想的成纤维细胞载体,为人羊膜成为组织工程皮肤的载体打下基础。

1.3 构建角膜组织工程修复材料

    以角膜缘干细胞为组织工程种子细胞,选用人羊膜作为负载细胞的材料,发现上皮细胞生长较快,形状和核浆比例正常,细胞之间可见桥粒;皮下埋植实验结果显示移植后8 d细胞就明显分化,形成了一层圆形和立方形的基底细胞、三四层翼状细胞和三四层扁平的表层细胞;溴苷染色标记细胞扩增实验表明细胞在21 d内均增生良好。将角膜缘干细胞培养在羊膜上一段时间后形成的角膜缘上皮细胞有连接蛋白43 表达。Koizumi等将羊膜负载角膜缘干细胞移植入兔角膜切除术的切口,术后5 d角膜缘上皮细胞完全覆盖切口并与周围的结膜上皮连接在一起。Koizumi等采用羊膜负载角膜缘干细胞治疗由Stevens-Johnson综合征等原因导致角膜缘干细胞缺乏征的患者11例13只眼,术后给予系统免疫抑制治疗防止免疫排斥。结果13 只眼术后48 h检查移植的角膜缘干细胞完全存活。术后随访视力均有提高,10只眼术后6个月恢复到良好的水平,有3只眼恢复较差,仅有光感和数手指的视力。羊膜上培养的角膜缘上皮细胞具有正常角膜上皮细胞的表型,而且表型的有无又是治疗角膜缘干细胞缺乏症的关键。王亚冬等培养角膜干细胞在保存人羊膜上能贴附、生长、分裂。经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似;自体组织工程化角膜上皮移植术后,细胞在受体角膜表面可以存活,细胞排列整齐,呈复层结构,有完整的基底膜;术后可有光滑湿润的眼表,角膜新生血管少,呈半透明状态,是修复眼表的理想技术。
    以口腔黏膜上皮细胞为组织工程种子细胞,选用人羊膜作为负载细胞的材料,细胞在羊膜上3 d内形成群落,在两三周分化成五六层细胞,表现相似于活体内正常角膜上皮细胞;角质蛋白4,13,3均在口腔黏膜细胞层中表达阳性;将羊膜负载口腔黏膜上皮细胞重建角膜发现第2天伤口有上皮形成,第10 天上皮细胞完全覆盖伤口并与结膜上皮连接,兔的角膜表面透明、光滑。羊膜负载口腔黏膜上皮细胞进行移植可以抑制纤维化和结膜上皮的入侵,保持角膜的透明和光滑,而且覆盖伤口速度快,已经广泛用于治疗严重的化学烧伤导致角膜上皮脱落、Stevens-Johnson综合征等疾病。Inatomi等采用羊膜负载患者自身的口腔黏膜上皮细胞,移植治疗Stevens-Johnson综合征、严重的化学烧伤、瘢痕性类天疱疮和原发性眼表疾病的患者12例15只眼,术后34个月随访,10只眼眼表稳定、透明,无并发症,所有患眼角膜周围血管化。这种外科手术可能是治疗严重眼表疾病的一种安全有效的方法。

1.4 构建肌腱组织工程修复材料

    以成纤维细胞为组织工程种子细胞,选用羊膜细胞外基质作为负载细胞的材料,修复1 cm长的兔跟腱缺损,用聚酯聚二氧杂环己烷缝线(PDS) 轴心桥接肌腱缺损,外包种植有成纤维细胞的羊膜细胞外基质膜。成纤维细胞在羊膜细胞外基质上生长良好,放射状或平行排列。羊膜细胞外基质负载成纤维细胞膜能够有效修复肌腱缺损,与正常肌腱相似,抗张强度达正常腱的81.8 %,可作为肌腱修复的一种选择方法。
    罗静聪等用羊膜细胞外基质包裹于修复的跟腱周围,实验侧跟腱吻合口周围的粘连带、肉芽组织、胶原纤维及成纤维细胞均明显少于对照侧;6,8 和12 周后取标本观察,仍有羊膜细胞外基质存在,无一肌腱坏死,每条肌腱均愈合。8 周后,羊膜细胞外基质开始降解,4个月后基本降解完全,与周围组织不易区分,羊膜细胞外基质对营养物质具有良好的通透性,不会造成肌腱坏死。因此,羊膜细胞外基质能有效预防跟腱粘连,是一种较为理想的预防跟腱粘连的生物材料。

1.5 构建骨组织工程修复材料

    采用人胚骨膜来源的成骨细胞与人羊膜体外复合培养构建组织工程骨膜,细胞与人羊膜结合后,所有标本Cbfa1和Osterix表达均为阳性,提示成骨细胞接种于人羊膜后并没有发生表型改变,而是继续保持成骨细胞的性状;胞增殖期间,大量成熟的成骨细胞进行有丝分裂,致使Cbfa1表达下调。随着增殖的完成,人羊膜对新生成骨细胞显示出良好的诱导分化作用,Cbfa1的表达逐渐上调。人羊膜作为支架材料,可诱导并促进成骨细胞分化。成骨细胞与人羊膜构建的组织工程骨膜在分子水平已具有产生骨组织的基础。
    采用Ⅱ型胶原酶消化解离兔髁突软骨中的纤维软骨细胞,取经转化生长因子2β1扩增的第2代细胞与羊膜复合培养,进行四甲基偶氮***盐、光镜、扫描电镜观察。髁突细胞于羊膜上牢固黏附,第3天开始增殖,3周时已有大量细胞生长于羊膜上。羊膜表现出良好的吸水性、细胞吸附性和体外生物相容性,髁突细胞可在其上黏附、增殖,羊膜适于作为髁突组织工程支架材料。

2 羊膜细胞作为组织工程种子细胞的应用

    由于羊膜形成于胚胎发生的早期阶段,羊膜含有未成熟的未分化细胞。羊膜细胞成分有羊膜上皮细胞,成纤维细胞及未分化的间充质细胞。成纤维细胞可产生胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、基质中多种糖蛋白(蛋白>糖)和蛋白多糖(糖>蛋白)、胶原、透明质酸、纤连蛋白等。间充质细胞有分化潜能,炎症时,可分化为树突细胞,成纤维细胞等。羊膜上皮细胞在体外能表达神经细胞神经胶质纤丝酸性蛋白和肝实质细胞分化标记物白蛋白和甲胎蛋白,这预示着羊膜上皮细胞可能成为神经或肝组织工程的种子细胞[27]。羊膜上皮细胞很少表达人类白细胞抗原A,B,C 或DR等抗原,移植后不易产生免疫排斥反应,目前已有学者开始探讨应用羊膜上皮细胞治疗各种原因引起的神经损伤、羊膜早破、角膜上皮缺损等多种疾病,因此羊膜上皮细胞可能是组织工程技术一种新的细胞来源。

3 问题与展望

    人羊膜与羊膜细胞外基质之所以在实验和临床中得到广泛的应用,主要是由于其特有的结构特点和促进组织修复的生物学基础。人羊膜与羊膜细胞外基质作为一种生物材料,其取材、保存和使用需遵循严格的医学标准,但目前尚无统一检测标准。羊膜复合体虽然已经用于角膜重建等临床应用,但是仍存在羊膜作为载体可能带来的潜在疾病;体外培养扩增细胞易发生“去分化”而失去原有特征等缺点。随着生物学技术和其他相关技术的发展,人羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中的应用潜能必将得到不断的展现?熏 组织工程化神经、皮肤、角膜、骨、肌腱将在不远的将来作为移植物应用于临床。

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